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Julio 2021 | Flores

Investigación de la Unal

Proponen un prototipo de formulación líquida a base de bacterias para control de Botrytis en rosas

Kelly Patricia Piraquive Riveros, investigadora de la Universidad Nacional de Colombia (Unal), propuso el desarrollo de un prototipo de formulación líquida a base de bacterias aerobias formadoras de endosporas-Bafes como principio activo, que fueron caracterizadas y evaluadas en condiciones de laboratorio, y que ayudarían a reducir la incidencia y severidad de la Botrytis cinerea en cultivos de rosas. Las Bafes analizadas presentaron hasta un 90% de inhibición del crecimiento del hongo y se proyectan con potencial para investigaciones futuras, incluso para el desarrollo de pruebas comerciales más adelante. La investigación partió de la evaluación de 12 cepas que incluyeron pruebas con aislamiento ‘in vitro’, para revisar si había algún mecanismo de control. A partir de allí fueron seleccionadas las que obtuvieron los mejores porcentajes de control con el fin de hacer el prototipo de formulación.

Ximena González V. Fotos: Kelly Piraquive

Antagonismo in vitro de Bacterias Aerobias Formadoras de Endosporas (control de Botrytis).

El moho gris, causado por Botrytis cinerea, es uno de los principales problemas fitopatológicos que afecta la producción de rosas en Colombia, ocasionando aproximadamente un 40% de pérdidas si es que no se previene ni controla oportunamente. Se trata de una enfermedad que ataca constantemente los cultivos de rosas en la Sabana de Bogotá y en Antioquia, y cuando es detectada en los pedidos que llegan a EE UU genera quejas e inconvenientes, poniendo en peligro la actividad de exportación.

Por ello, ante esta situación, y debido a la resistencia que ha venido presentando la enfermedad a ciertos plaguicidas, Kelly Patricia Piraquive Riveros, investigadora de la Universidad Nacional de Colombia (Unal), propuso el desarrollo de un prototipo de formulación líquida a base de bacterias aerobias formadoras de endosporas-Bafes como principio activo, que fueron caracterizadas y evaluadas en condiciones de laboratorio, y que ayudan a reducir la incidencia y severidad de Botrytis cinerea en cultivos de rosas.

Inhibición del hongo

En la investigación se evidenció una alta variabilidad en los cultivos de rosas de la sabana de Bogotá y se consiguieron diferentes aislamientos de Botrytis en distintas fincas de la sabana.

El estudio trabajó con 10 aislamientos diferentes, lo que dio un abanico muy amplio y permitió retar aún más las bacterias probadas en el prototipo de formulación.

Aunque en el mercado existen productos con características similares no son una opción sostenible, por lo que existe la necesidad apremiante de seguir explorándolas.

En tal sentido, la investigadora destaca que los prototipos con BAFES, no solo son recomendables para el ambiente, sino para la salud de las personas, específicamente aquellas que se dedican a aplicar los fungicidas en los cultivos.

“Se debe tener también muy presente que, en la medida que se suplan ese tipo de demandas seremos, no solo más sostenibles, sino más atractivos para los negocios internacionales, que aportan mucho a la economía nacional”, destaca.

Proceso de obtención de prototipos.

“El trabajo que hicimos se basó en investigaciones anteriores. Queríamos indagar si estas cepas de bacterias aerobias formadoras de endosporas controlaban la botrytis en las rosas o no. A partir de ahí nos dimos cuenta de que estas bacterias sí podían hacer control de esta enfermedad”, destaca Piraquive, señalando además que la investigación partió de la evaluación de 12 cepas que incluyeron pruebas con aislamiento in vitro, para revisar si había algún mecanismo de control. A partir de allí fueron seleccionadas las que obtuvieron los mejores porcentajes de control con el fin de hacer un prototipo de formulación líquida con estas bacterias.

“El profesor Daniel Uribe ya había hecho unos intentos de formulación, pero con levadura y en formulación sólida, de ahí salieron unos resultados importantes de control, pero al hacer las mezclas correspondientes se pudo notar que se presentaban unos problemas de residualidad que afectaban o impactaban la estética de la flor. Esos inconvenientes de tipo estético no eran convenientes para el producto en sí pese a que sus pruebas de efectividad eran buenas”, explica.

Por ello, destaca que se exploró en la posibilidad de utilizar estas bacterias en una formulación líquida que por las condiciones propias de las mismas, que son Bacillus esporulados, son muy convenientes para ser utilizadas en los procesos de formulación.

“Partimos de esas cepas que teníamos de base y en la fase ‘in vitro’ lo que hicimos fue enfrentarlas contra diez aislamientos de botrytis diferentes. Lo que queríamos era probar si estas cepas eran lo suficientemente versátiles y fuertes como para combatir no solo un tipo de botrytis sino diez tipos diferentes de la enfermedad”, explica y añade que fue un trabajo arduo pues por la ventana de tiempo con la que contaban en su trabajo de investigación debían hacer la selección de una sola cepa de base que atacara un solo aislamiento de botrytis.

Después de las pruebas ‘in vitro’, se pasó a la fase ‘in vivo’. Ahí se utilizaron pétalos de flor y se definió una sola cepa para desarrollar el proceso de formulación, que componía una estructura de resistencia llamada endospora -producida cuando las condiciones en el medio son adversas- y otra de metabolitos secundarios, producidos durante el proceso de fermentación, para llegar a las esporas.

Ensayos ‘in vivo’ para evaluación de afección por Botrytis en pétalos de rosa.

Los prototipos de formulación evaluados que presentaron mejores porcentajes de eficacia fueron los que estuvieron almacenados a 4°C, en contraste con los almacenados a 25°C, que mostraron bajos porcentajes de eficacia.

Se revisó que el prototipo con bacterias tuviese un buen adhesivo al tejido vegetal y que los preservantes probados pudieran contrarrestar la acción de otros microorganismos que llegarían a afectar la viabilidad del producto.

Tras ello, se realizaron pruebas en el agente suspensor y el agente tensoactivo, para que el ingrediente activo (las bacterias) estuviera en suspensión permanentemente y propender por una cobertura óptima del producto ante la actividad vegetal.

“Con la cepa seleccionada hicimos unas pruebas con diferentes componentes que íbamos a probar para revisar que no fueran a comprometer la viabilidad del microorganismo. En esta fase ‘in vivo’ probamos polímeros, preservantes y agentes de suspensión, estos compuestos son los que la literatura nos reportaba que necesitaban ir en combinación con nuestra base para que pudiera llamarse como tal formulación y que pudiera aplicarse en planta para hacer las pruebas de actividad. Al hacer la selección de los compuestos y al verificar la viabilidad celular hicimos la mezcla con nuestra cepa base y de ahí obtuvimos nuestro prototipo de formulación”.

PRUEBAS DE VIABILIDAD DEL PROTOTIPO DE FORMULACIÓN PARA EL CONTROL DE BOTRYTIS EN ROSAS

La investigadora destaca que una vez se logró obtener el prototipo de formulación, se pasó a hacer las pruebas de viabilidad para saber cuánto estaba durando viva la bacteria en un determinado lapso de tiempo. Se realizaron pruebas el día uno, a los 30 días, 60, 90 y 120 días. Además, adicional a eso, se realizaron pruebas de actividad, para ver cómo estaban peleando estas bacterias formuladas con diferentes compuestos sobre el pétalo y sobre la flor completa. Entonces se hizo la verificación para notar si realmente estaban atacando al hongo y si estaban bajando la incidencia de la enfermedad.

Factores determinantes para que haya presencia de botrytis

De acuerdo con Piraquive para que haya presencia de botrytis debe haber una conjunción de varias cosas. “La primera sería una temperatura favorable entre 18°C a 25°C, adicional a eso debe haber presencia de nutrientes para que el hongo tenga de qué alimentarse y esos nutrientes vienen principalmente por exudados que salen a través de heridas que pueden estar presentes en el tejido vegetal. Esos exudados presentan esa comida que el hongo necesita para poder desarrollarse. Además, adicional a eso también tendría que haber en el ambiente una alta humedad relativa entre 90% y 100%, la necesaria para que el hongo crezca, esporule y cumpla todo un ciclo de infección en el invernadero o la zona donde esté presente el inóculo”, dijo la investigadora.

“En la primera fase que fue la ‘in vitro’ nos dimos cuenta que al evaluar las 12 cepas base contra los 10 aislamientos de botrytis había un 90% de control, es decir, las bacterias lograban controlar el crecimiento del hongo en caja de Petri y tenían un porcentaje de control superior al 90%”, precisa la investigadora e indica que durante las pruebas ‘in vivo’ notaron que el porcentaje de control disminuye porque las condiciones son diferentes.

“En la fase ‘in vivo’ vimos que el porcentaje de eficacia fue superior al 70% en los prototipos que estuvieron almacenados en frío (4°C) y lo que vimos es que los prototipos que propusimos tenían un comportamiento bastante parecido al testigo comercial (producto de síntesis química que ya se utiliza de forma permanente y que ya se sabe que funciona). Utilizamos un producto de síntesis química con modo de acción preventivo”, explica. Asimismo, los prototipos que estaban almacenados a 25°C tuvieron un porcentaje de eficacia inferior al 30%, muy por debajo del testigo comercial, lo que quiere decir que la temperatura es fundamental para preservar la actividad de ciertos compuestos presentes en el prototipo de formulación.

SE DEBE AVANZAR EN EL PROTOTIPO DE FORMULACIÓN

Kelly Patricia Piraquive Riveros, magíster en Microbiología, de la Universidad Nacional de Colombia-Unal.

Aunque el prototipo de formulación para el control de botrytis en rosas con bacterias solo hizo parte de su tesis de grado, Piraquive destaca que estos quedaron en almacenamiento en laboratorio y tras un año, las bacterias seguían vivas. “En el laboratorio se continuó chequeando la viabilidad del prototipo de formulación líquida a base de bacterias aerobias formadoras de endosporas-Bafes y después de un año seguían vivas, lo cual es muy bueno porque da unos visos de que el producto es muy prometedor y de que podría continuarse con la investigación para saber si se puede lanzar eventualmente una prueba comercial”, concluye.

Según explica la experta, las bases de las cepas de Bafes tienen muchos modos de acción. Un primer mecanismo de control puede ser la antibiosis, el mecanismo más conocido de control de Bacillus. Básicamente lo que hace es presentar una actividad inhibitoria contra diferentes microorganismos fitopatógenos, en este caso botrytis.

Piraquive destaca que otra forma de actuar de estos microorganismos puede ser el de la producción de enzimas líticas, que son los compuestos que interfieren con la actividad metabólica y el crecimiento del fitopatógeno. Otro mecanismo de acción es la competencia por espacio y nutrientes, es decir que, la bacteria le gana terreno al hongo al colonizar el espacio en el medio. Y hay otro mecanismo que es la producción de compuestos orgánicos volátiles que son unos compuestos que inhiben o previenen el crecimiento del hongo al debilitar las esporas que participan activamente.