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Noviembre 2019 | Enfermedades

Y detección de bacterias resistentes a los cobres

Caracterización del agente causal del cáncer bacterial en cerezo

El uso intensivo de formulaciones de cobre no solo favorece la aparición de bacterias resistentes, sino que dañan la microbiota del suelo. En la Región de O´Higgins, la población bacteriana asociada al Cáncer Bacterial presenta alta resistencia a cobre (Cu+2). Un nuevo método de identificación molecular desarrollado por INIA, permite detectar y discriminar las variantes genéticas de la bacteria causante del cáncer bacterial en cerezo.

Beltrán M.F.1, Sagredo B.1, Osorio V.1, Millas P.2, France A.2, Lemus G.1.

1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional Rayentué, Rengo. 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional Quilamapu, Chillán.

El cerezo es la especie frutal que mayor crecimiento ha tenido en las últimas décadas en nuestro país. El cáncer bacterial, por su parte, es una enfermedad que afecta al cerezo y que genera, desde el punto de vista sanitario, pérdidas significativas; representando una de las principales amenazas al potencial productivo de esta especie en Chile. Sin embargo, aun no existen herramientas eficaces para su control.

En los frutales de carozo, como el cerezo, el agente causal de la enfermedad son variantes genéticas de la bacteria Pseudomonas syringae, conocidas como patovares correspondientes a P. syringae pv. syringae (Pss) y P. syringae pv. morsprunorum raza 1 y 2 (Psm1 y Psm2), estas últimas solo se han descrito en Europa y EEUU. En tanto que en Chile son consideradas cuarentenarias por el SAG.

Este patógeno, en su fase epífita, normalmente se encuentra en la superficie de hojas y tallos de la planta, así como en malezas y flora asociada al huerto. De esta forma sobrevive y se multiplica hasta alcanzar el potencial de inóculo, para luego, en su fase endófita, penetrar en la planta por estomas, grietas de crecimiento, cicatrices por caídas de hojas y heridas.

Existen dos factores que aumentan la capacidad de la bacteria para causar la enfermedad, estos son: la producción de una poderosa toxina, llamada syringomicina, que destruye los tejidos de la planta a medida que las bacterias se multiplican en la herida, y la liberación de una proteína que actúa como un núcleo de hielo, aumentando las heridas por heladas y favoreciendo la colonización y expansión de la bacteria.

Los síntomas característicos generados por Pss incluyen: cancros que exudan goma, atizonamiento de flores, muerte de ramillas, lesiones en frutos y hojas, disminución de los rendimientos, entre otros.

Actualmente, el control del cáncer bacterial se basa en un enfoque preventivo, ya que no existen controles curativos efectivos que permitan erradicar la enfermedad una vez que la bacteria colonizó endófitamente la planta. En este control preventivo se utilizan compuestos en base a cobre (Cu+2), combinado con prácticas culturales, que consisten en la eliminación de ramas secas y tejido infectado, extirpación de cancros de mayor tamaño y protección de heridas con pasta fungicida. El control químico se basa en tratamientos foliares y protección de troncos con compuestos cúpricos (óxido de cobre, caldo bordeles, oxicloruro de cobre, hidróxido de cobre), que representan el 80% de los productos con autorización vigente en Chile (www.sag.gob.cl, marzo 2019). Sin embargo, el uso de estos productos para el control del cáncer bacterial no ha sido efectivo. Se han detectado bacterias resistentes al cobre en zonas de cultivo de cerezo, lo que compromete las tácticas de control químico.

Figura 1. Gráfico de frecuencia de aislamientos sensibles y resistentes según concentración mínima inhibitoria al sulfato de cobre.

Para un control más efectivo del cáncer bacterial sería necesario conocer con detalle las características que determinan el desarrollo de la enfermedad y cómo se conjugan los factores ambientales, del huésped y el patógeno. Existen pocos estudios en Chile que aborden todos estos aspectos, la mayoría de ellos ponen énfasis en la validación de productos para el control de la enfermedad. Los principales trabajos de caracterización del agente causal del cáncer bacterial en frutales de carozo, datan de los años 70’- 80’, en los que mediante la utilización de pruebas fisiológicas y bioquímicas identificaron a Pss como el agente causal. Estudios relacionados con la diversidad/identidad genética de las poblaciones, niveles de virulencia y presencia de resistencia a compuestos de cobre no han sido reportados en Chile.

EVALUACIÓN DE RESISTENCIA AL COBRE DE AISLAMIENTOSBACTERIANOS OBTENIDOS DE PLANTAS CON SÍNTOMAS DEL CÁNCER BACTERIAL

Para esto, se preparó una suspensión bacteriana de concentración conocida de cada aislamiento, y se sembró en una placa con medio de cultivo MGY suplementado con sulfato de cobre (CuSO4·5H2O). Cada suspensión bacteriana se sembró en 10 placas de cultivo con concentraciones de [0] a [3,6] mM. Se evaluó la concentración mínima inhibitoria (MIC), como la concentración máxima de sulfato de cobre que puede resistir un aislamiento sin ser ésta letal. Un aislamiento resistente es capaz de desarrollar colonias a partir de [1,2] mM.

Determinación de concentración mínima inhibitoria al sulfato de cobre en tres aislamientos bacterianos. A. Aislamiento sensible, MIC [0,8] mM. B. Aislamiento con resistencia moderada, MIC [2,4] mM. C. Aislamiento alta resistencia, MIC [3,6] mM.

CREACIÓN DE UN SISTEMA EFICAZ Y DE ALTA SENSIBILIDAD PARA DETECTAR BACTERIAS

Parte de estas interrogantes están siendo abordadas en el proyecto FIC Regional “Transferencia Control Cáncer Bacteriano en Huertos de Cerezos”, ejecutado por investigadores de INIA-Rayentué, en colaboración con investigadores de INIA-Quilamapu. Como parte de los objetivos del proyecto, se buscó establecer un sistema rápido, eficaz y de alta sensibilidad para identificar los microorganimos causantes del cáncer bacteriano en plantas de cerezo. La colaboración con huertos productivos de la Región de O’Higgins, ha facilitado la obtención de muestras de cerezo con síntomas del cáncer bacterial y posterior aislamiento de bacterias. Hoy en día se cuenta con un set de aislamientos bacterianos asociados al cáncer bacterial provenientes de diferentes comunas de la región, diferentes variedades y zonas climáticas. Este set de aislamientos fue el material base para el desarrollo de un método de identificación, y también para establecer la presencia de bacterias resistentes al cobre en huertos de cerezo de la región de O’Higgins.

 

El método de identificación de Pss, recientemente, desarrollado se basa en la detección molecular de genes específicos del patovar syringae y que permite discriminarlo de los patovares Psm1 y Psm2 por diferencias en la secuencia de ADN (Recuadro 1). Este método fue validado con el análisis de 80 aislamientos bacterianos, los cuales fueron previamente caracterizados como causantes de la enfermedad, por su grado de patogenicidad a través de un ensayo con frutos inmaduros de cerezo (fase amarillo pintón). El método desarrollado confirmó la identificación de 10 de estos aislamientos patogénicos como Pss. Por otro lado, este mismo set, de 80 aislamientos bacterianos, fue analizado en cuanto a la habilidad de resistir concentraciones crecientes de cobre (Recuadro 2). El 80% de los aislamientos evaluados resultó ser resistente al cobre en diferentes grados, incluyendo 11 de los aislamientos patogénicos (Figura 1). Estos resultados son una evidencia clara, de la existencia de aislados asociados al cáncer bacterial resistentes al cobre en los huertos de la Región de O’Higgins.

Esta situación es esperable si consideramos que la Región de O´Higgins presenta un alto contenido de Cu+2 en suelos, por actividades propias de la fruticultura intensiva y/o contaminación de la minería cúprica. Por lo mismo, no se recomienda el uso intensivo de productos de cobre, ya que las concentraciones en el suelo pueden llegar a niveles tóxicos después de varias décadas de uso. El llamado es a replantearse el uso de los productos fitosanitarios en base a cobre, ya que el uso intensivo de formulaciones de cobre no solo favorece la aparición de bacterias resistentes, sino que además, dañan la microbiota del suelo.

ETAPAS EN EL DESARROLLO DE UN MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. SYRINGAE

ETAPA 1: Aplicación de métodos de identificación fisiológica y bioquímica

Los métodos de identificación fisiológica y bioquímica como lo son: visualización de fluorescencia en medio B de King, pruebas LOPAT y de hipersensibilidad en plantas de Tabaco (Figura 1) han sido ampliamente utilizados para la caracterización de aislamientos de Pseudomonas, no obstante, la discriminación de especies es difícil y no siempre acertada.

ETAPA 2: Aplicación de métodos moleculares

Se extrajo ADN a partir de cultivos puros del set de aislamientos bacterianos disponibles, y se realizó la detección de genes mediante PCR reportados en la literatura específicos del género Pseduomonas, como lo son los genes de referencia encoding sigma factor 70 (rpoD) y citrate synthase (cts), y genes específicos del patovar syringae como los que codifican la fitotoxina syringomicina (syrB y syrD) (Figura 2).

Con los resultados de la aplicación de los métodos fisiológicos y bioquímicos, así como los moleculares, se seleccionaron aislamientos bacterianos de los cuales se obtuvo la secuencia del genoma. Con esto, un aislamiento se identificó como Pss, a partir de la comparación de su genoma ensamblado con genomas de Pss disponibles en la base de datos.

ETAPA 3: Desarrollo de método de identificación molecular específico de Pss.

Tomando como base la secuencia de ADN del genoma ensamblado, se comparó la secuencia de siete genes de referencia, con la de otros aislamientos de Pss disponibles en la base de datos y de aislamientos del patovar morsprunorum reportados. Aunque estos genes son altamente conservados entre individuos de la misma especie, existen cambios en la secuencia de ADN entre patovares. Se buscaron cambios que permitieran diferenciar los patovares syringae y morsprunorum, los que fueron detectados mediante la técnica de HRM-PCR, que permite evaluar estas diferencias en cuanto a la temperatura de fusión de los productos de PCR generados (Figura 3). 

Figura 1. Métodos utilizados para la identificación de P. syringae pv. syringae basado en pruebas fisiológicas y bioquímicas.

Figura 2. Detección de producto de PCR en gel de agarosa. A. Marcador del género Pseudomonas. B. Marcador de P. syringae pv. syringae. Flecha indica producto del tamaño esperado.

Figura 3. Curvas de fusión (Raw/derivative) HRM de productos de PCR. A. Marcador exclusivo de muestra de Pss. B. Marcador permite diferenciar muestras de Pss y Psm.