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Agosto 2018 | Enfermedades

Control Químico: alternativas actuales y futuras para ser consideradas en el diseño de programas óptimos de control

El A, B, C de Botrytis en uva de mesa de exportación

  

Cada vez que termina una temporada y se reciben los resultados de la llegada de nuestra fruta en los mercados de destino, unos quedan satisfechos, otros un poco confusos y algunos otros, comienzan a preguntarse: ¿Qué hemos hecho mal o qué no hicimos en forma inadecuada para controlar en forma exitosa a Botrytis? Principal causal de rechazo de nuestra uva de exportación. En el presente artículo abordamos algunos de los factores más importantes que deben tenerse en cuenta para tratar de asegurar un control efectivo de este patógeno.

Marcela Esterio Grez, Ing. Agr. Mg. Cs., Fitopatólogo Universidad de Chile

Está más que claro que el control de la pudrición gris causada por Botrytis spp. requiere de un manejo integrado, en donde se complementen prácticas culturales que permitan una adecuada ventilación, tanto a nivel de la canopia como al interior del racimo, y una fertilización balanceada, entre otras medidas. Pero, sin lugar a dudas, uno de los factores más importantes y base del manejo de este gran problema, es el Control Químico. El éxito de éste va a depender de la situación de sensibilidad de las poblaciones locales del hongo a nivel local-predial y de cómo disponemos las distintas alternativas botryticidas -actualmente registradas- en los distintos periodos críticos de infección.

Antes de analizar las distintas alternativas botryticidas existentes y las nuevas, prontas a introducirse en el mercado nacional, es conveniente recordar algunas de las características más relevantes de este patógeno, que lo hacen tan problemático para la uva de mesa y muchas otras especies de importancia económica a nivel mundial.

Figura 1. Línea de tiempo de detección de Resistencia a moléculas de acción botryticida en Chile.

COMPORTAMIENTO DE BOTRYTIS COMO PATÓGENO

Botrytis es un hongo capaz de sobrevivir tanto durante el periodo de crecimiento activo de la planta así como en el receso, en forma de micelio esporulante sobre restos de tejidos afectados, como así mismo en el receso formando esclerocios en restos de poda y peciolos dispuestos en el piso de los huertos; pero además, en algunas malezas. O sea, está presente durante todo el año.

Por otro lado, debemos considerar a este patógeno como a una población dinámica, de alta variabilidad genética, que responde rápidamente al manejo agroecológico al que es sometida, razón por la que los programas de control no obtienen el mismo resultado en las distintas zonas productoras, en predios de una misma zona, o incluso en predios vecinos. Además, por la gran capacidad que tiene este hongo de adaptarse a las distintas condiciones, cuando es sometido a una alta presión de selección por determinadas moléculas fungicidas, puede generar rápidamente resistencia. Hasta el momento son pocas las moléculas fungicidas a las que no se han detectado problemas de pérdida de sensibilidad en botrytis, ya sea en Chile como a nivel mundial (Figura 1: recuadro de línea de tiempo de primeros reportes de resistencia en distintos botryticidas en Chile).

Y es este último punto el cual incide más negativamente en los resultados de los programas de control, por ello es que -en los últimos años- la gran mayoría de los productores han incorporado en sus tareas habituales realizar chequeos de sensibilidad a al menos algunas de las moléculas fungicidas más utilizadas en las temporadas precedentes.

La información que entregan estos monitoreos es importante, pero es aún más relevante la interpretación de estos resultados y el poder determinar la causa real de la pérdida de sensibilidad a las moléculas que se utilizan en los periodos críticos de infección más importantes (floración y desde preenvero a cosecha). O sea, conocer qué tipo de mutación es la predominante en la población resistente del hongo a un determinado fungicida a nivel predial-local.

En el Laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular de la Universidad de Chile, llevamos más de tres décadas de investigación centrada en este patógeno. Comenzamos analizando sus poblaciones fenotípicamente y a nivel molecular, determinándose las implicancias de la variabilidad genética en la respuesta a fungicidas, e implementando las primeras técnicas moleculares de diagnóstico molecular de resistencia a hydroxyanilidas y a dicarboximidas (Proyecto CORFO, 2007-2010). Posteriormente, continuamos analizando la situación de sensibilidad de las poblaciones en las regiones productoras de uva de mesa que presentaban mayores condiciones predisponentes a las infecciones por botrytis (Proyecto CORFO 2011-2013). Y actualmente, en los dos últimos años, estábamos empeñados en diseñar programas óptimos de control mediante una detección temprana de la presencia de mutaciones asociadas a pérdida de sensibilidad a hydroxyanilidas y a carboxamidas, con el uso de las moléculas botryticidas base (cyprodinil & fludioxonil; hydroxyanilidas (fenhexamid), aminopyrazolinonas (fenpyrazamine) y a carboxamidas (boscalid, fluopyram, isofetamida y adepidyn). Así como la incorporación de las recientes moléculas de acción botryticida alternativas no residuales, como lo son algunos extractos de plantas (Melaleuca alternifolia), algunos antagonistas biológicos (Trichoderma spp., Bacillus subtilis y bacillus amiloliquefaciens) (Proyecto FIA PYT: 2016-0243). Parte de estos resultados se presentarán más adelante en este artículo.

Figura 2. Situación actual del nivel de sensibilidad a A) cyprodinil & fludioxonil y B) fludioxonil de poblaciones de Botrytis sp. recuperadas desde flores y bayas asintomáticas de uva de mesa cv. Thompson Seedless, durante la temporada 2016/17 (floración y precosecha) y la floración de temporada 2017/18 (EC50> 1µg/mL). (Proyecto FIA – U. de Chile, PYT-2016-0243).

¿CUÁLES SON LAS MOLÉCULAS BOTRYTICIDAS DE MAYOR EFICIENCIA ACTUALMENTE CON REGISTRO EN CHILE?

Además, ¿cuáles son sus principales modos de acción y períodos críticos en los cuales deberían posicionarse en uva de mesa y nivel de riesgo de desarrollo de resistencia?

Anilinopyrimidinas (AP), actualmente representadas por tres moléculas en Chile. La primera introducida fue cyprodinil, la que forma parte de la mezcla botryticida actualmente de mayor eficiencia en el control de Botrytis en Chile (cyprodinil & fludioxonil); pyrimethanil es otra AP disponible sola y en mezcla con trifloxystrobin y la tercera AP, recientemente disponible en el país, corresponde a mepanypirim. Inicialmente se indicaba que las AP inhibían la biosíntesis de la metionina y de otros aminoácidos y también la secreción de enzimas hidrolíticas involucradas en la patogénesis del hongo. Hoy en día, estudios recientes realizados por líderes en investigación en resistencia a fungicidas a nivel mundial, señalan que la inhibición de la biosíntesis de la metionina sería un efecto indirecto y que su acción estaría asociada al menos con 9 genes distintos, dos de los cuales serían los responsables de la pérdida de sensibilidad de los aislados a nivel de campo, los que estarían relacionados con la formación de proteínas involucradas en procesos a nivel mitocondrial, afectando la respiración de los aislados fungosos.

Cyprodinil & fludioxonil, mezcla fungicida base de los programas de control de botrytis, introducida en el país en la década del 90, exactamente a partir de 1995, y que a la fecha ha mantenido un nivel de eficacia aceptable. La unión de sus ingredientes activos genera una doble protección, cyprodinil inhibe principalmente la elongación del tubo germinativo y el crecimiento miceliar y fludioxonil -al afectar las señales de transmisión de osmorregulación- incide en la germinación conidial (prácticamente revienta las conidias). En 2009, en algunos huertos de la Región Metropolitana y de la Región de O’Higgins, se detectaron algunos aislados que superaban el punto de corte de sensibilidad considerado como discriminante en esos años para la mezcla (EC50 > 0,5 µg/mL). Sin embargo, estudios posteriores establecieron que este comportamiento estaba asociado a resistencia del tipo multidroga, por uso de subdosis, más que a una resistencia específica propiamente tal. En análisis efectuados durante las últimas dos temporadas considerando como puntos críticos de sensibilidad para la mezcla como para fludioxonil a 1µg/mL, el cien por ciento de los aislados presentó alta sensibilidad a la mezcla. Sin embargo, en post-aplicación de plena flor, en las dos temporadas analizadas se detectaron los primeros aislados resistentes a fludioxonil, pero con una muy baja frecuencia en las poblaciones de botrytis analizadas (1,98 y 2,l 9 % de aislados resistentes con EC50 >  1 µg/mL) (solo 13 de 658 y 10 de 457 aislados, floración 2016/17 y floración 2017/18, respectivamente) (Figura 2 A y B). Aunque este resultado, por la baja frecuencia de aislados resistentes detectada es solo una alerta, y no constituye por el momento un riesgo de pérdida de sensibilidad para la mezcla cyprodinil & fludioxonil, podría ser preocupante si se incrementa el número de aplicaciones de ésta u otras mezclas que consideran como segundo ingrediente activo a fludioxonil, y que también se estén posicionando en floración y en precosecha, como es el caso de la mezcla fenhexamid & fludioxonil.

El posicionamiento ideal para la mezcla es en floración, de preferencia a inicio o plena flor, y en envero.

Hydroxyanilidas, representada por fenhexamid, única molécula de acción botryticida específica a nivel mundial, la que se introdujo en el mercado nacional a inicios de la década del 2000. Esta molécula actúa inhibiendo el complejo enzimático de la 3-ketoreductasa de la dimetilación del carbono 4 durante la biosíntesis del esterol, con efecto sobre el desarrollo de los tubos germinativos, los que se deforman y mueren antes de ser capaces de penetrar la superficie del tejido vegetal. Actualmente, existen en el país al menos 3 fungicidas formulados con este ingrediente activo, el original y dos genéricos. Independientemente de la formulación, precosecha es el posicionamiento ideal para esta molécula, por sus características de botryticida específico y presentar registro y una alta tolerancia en los principales mercados de destino de la uva de mesa chilena.

El riesgo de generar resistencia a fenhexamid desde el principio era medio a alto por ser específico para botrytis y su acción asociada a un solo gen. El primer reporte de resistencia en Chile data de 2007 (Figura 1), inicialmente el punto de corte discriminatorio de sensibilidad era bastante bajo (0,1 a 0,17 µg/mL), actualmente se consideran aislados resistentes a aquellos que crecen por sobre 2 µg/mL e incluso en otros estudios por sobre 4 µg/mL.

La pérdida de sensibilidad a este importante botryticida está asociada a mutaciones en el gen erg27, el que codifica para la enzima 3 ketoreductasa. Aunque se han detectado muchas mutaciones en este gen, los niveles de alta resistencia corresponden a cambios aminoacídicos en la posición 412 de este dominio transmembrana, en el que una histidina es reemplazada por una serina, o bien el reemplazo es por una isoleucina o por una valina.

Cuadro 1. Cambios en la frecuencia de mutaciones asociadas a pérdida de sensibilidad a fenhexamid y/o fenpyrazamine a través del tiempo. Resultados expresan el porcentaje de aislados de Botrytis que se comportaron como sensibles (sin mutación) respecto de los resistentes según mutación, desde Floración 2016/17 a Floración 2017/18 (n° total de aislados analizados fluctuante por periodo entre 666 y 660 aislados).

Figura 3. Situación actual del nivel de sensibilidad a fenhexamid en aislados de Botrytis spp. recuperados desde flores y bayas asintomáticas de uva de mesa cv Thompson Seedless, en distintas épocas desde precosecha 2015/16 a floración de temporada 2017/18. (Punto crítico de corte discriminatorio de aislados sensibles v/s resistentes: EC50> 2 µg/mL). Nótese la tendencia a disminución de aislados resistentes, sobre todo desde precosecha 2016/17 a la floración de temporada siguiente en donde de 90,45 % baja a 78,04%, respectivamente. (Proyecto FIA – U. de Chile, PYT-2016-0243).

En los primeros estudios realizados, las mutaciones detectadas en las poblaciones locales resistentes a fenhexamid correspondían predominantemente a serina y en una baja proporción a valina (Proyecto U. de Chile / InnovaChile de Corfo, 2007-2010). Actualmente, en los resultados obtenidos en Proyecto FIA (en ejecución), se mantiene el predominio de los mutantes-serina (59 a 67%), pero detectándose además los primeros aislados chilenos mutantes-isoleucina, en una menor pero importante proporción en floración de la temporada 2016-17. Esta última mutación, que si estaba reportada en aislados franceses, pero no en Chile, presentó una frecuencia de hasta 18,6% (floración de 2016/17). En el caso de los aislados resistentes mutantes-valina, se mantuvo la baja frecuencia inicialmente detectada en el primer estudio con una menor y escasa o nula presencia en las poblaciones resistentes analizadas, aparentemente estos aislados resistentes serían los menos estables (véase Cuadro 1).

En Chile, en las dos últimas temporadas, luego de analizar más de 660 aislados, se detectó un predominio de aislados resistentes a fenhexamid por sobre los sensibles (Cuadro 1). Sin embargo, es importante señalar que, según nuestros resultados, existe una tendencia positiva a la recuperación de la población sensible a fenhexamid, lo cual es muy importante por las características propias ya mencionadas de este botryticida y por ser la alternativa por excelencia para ser utilizada en precosecha (Figura 3).

¿Qué importancia tiene que la resistencia se asocie a una u otra mutación en una población de botrytis a nivel local? 

Es bastante más importante de lo que se podría pensar, porque según resultados generados por Memoria de Título U. de Chile (M. Azocar) y Proyecto FIA PYT-2016-0243, los aislados resistentes mutantes-isoleucina y serina presentan una mayor agresividad que los sensibles, tanto a 0°C como a temperaturas de estantería (20°C) (Figura 4). En cambio, los aislados mutantes-valina, generalmente, son menos agresivos que los otros mutantes e incluso que los sensibles, y por ello es que los análisis de resistencia basados solo en determinaciones de valores EC50, no aportan toda la información relevante y necesaria para un análisis en profundidad de una situación de pérdida de sensibilidad particular.

Figura 4. Agresividad de aislados de B. cinerea de distinto nivel de sensibilidad a fenhexamid (con y sin mutaciones asociadas), en bayas cv. Th. Seedless con y sin herida incubadas a 20°C y 0°C.

Aminopyrazolinonas, representada por fenpyrazamine, molécula que presenta el mismo modo de acción y características que fenhexamid, podríamos decir que es un primo hermano, por lo que presenta en general los mismos problemas de pérdida de sensibilidad que éste último. Es decir, los aislados que son resistentes a fenhexamid también lo son en menor o mayor grado a fenpyrazamine. Ahora bien, por no presentar registro en algunos de los mercados de destino, su posicionamiento ha sido considerado más temprano, al término del periodo de floración; siempre y cuando la población de botrytis presente una mayor sensibilidad a estas moléculas y que previo a su aplicación en inicio de flor, la protección sea en base a una mezcla botryticida de alta eficiencia (aplicación en inicio de flor con cyprodinil & fludioxonil o con algunas de las nuevas carboxamidas).

Carboxamidas, boscalid fue la primera de las moléculas de esta familia que se utilizó en vides para el control de botrytis, siendo  introducida con este propósito a mediados de 2000. Boscalid afecta la respiración mitocondrial, inhibiendo el transporte de electrones en el complejo II, impidiendo la formación de energía (ATP).

Como puede observarse en la Figura 1, la primera referencia de pérdida de sensibilidad en Chile a esta molécula data de 2011. Inicialmente se consideraban aislados resistentes a boscalid cuando los valores EC50 superaban los 0,5 µg/mL.

La pérdida de sensibilidad en botrytis está asociada principalmente a mutaciones en la subunidad B de la enzima succinato deshidrogenasa, en las posiciones 272 (cambios de histidina por arginina (H272R), por tirosina (H272Y), por leucina (H272L) o por valina (H272V)), 230 (con cambios de asparagina por isoleucina (N230I), en 225 (con cambios de prolina por fenilalanina (P225F), por leucina (P225L) o por histidina (P225H). Así como en la subunidad D, con cambios de histidina por arginina en la posición 132 y en la subunidad C, en la posición 37, con cambios de glicina a serina (Figura 5). De todas las mutaciones asociadas a pérdida de sensibilidad a boscalid, las predominantes en los aislados chilenos son la H272R, H272Y y la P225H (Figuras 5 y 6).

Figura 5. a) Esquema de la enzima succinato deshidrogenasa en donde actúan las carboxamidas en botrytis y mutaciones detectadas a nivel mundial b) Mutaciones asociadas a resistencia a boscalid en Chile, y c) Sensibilidad diferencial de algunos aislados mutantes a distintas carboxamidas.

Figura 6. Frecuencia de principales mutaciones detectadas en aislados de Botrytis spp. resistentes a boscalid (EC50 >15 µg/mL), en posiciones 272 (A) y 225 (B), recuperados desde flores y bayas asintomáticas de vides cv. Thompson Seedless, en distintas épocas desde precosecha 2015/16 a floración de temporada 2017/18. (Proyecto FIA – U. de Chile, PYT-2016-0243).

Figura 7. Cambios en los niveles de sensibilidad a boscalid en poblaciones de Botrytis spp. recuperadas desde flores y bayas asintomáticas de uva de mesa cv Thompson Seedless, en distintas épocas desde precosecha 2015/16 a floración de temporada 2017/18. (EC50> 15 µg/mL). (Proyecto FIA – U. de Chile, PYT-2016-0243).

Actualmente se consideran aislados resistentes a boscalid aquellos que presentan valores EC50 > a 15 µg/mL. Los resultados obtenidos en las últimas dos temporadas señalan un incremento notable en los valores EC50 de boscalid, en la población de aislados analizada, los cuales varían  aproximadamente de 48 a 71 µg/mL (valores EC50 de precosecha 2015/16 y floración 2017/18, respectivamente) (Figura 7).

Este antecedente es realmente muy importante porque todas las nuevas moléculas de acción botryticida recientemente introducidas y otras prontas a obtener registro corresponden a Carboxamidas de última generación.

Fluopyram es una de estas nuevas carboxamidas, su introducción en el mercado nacional para uva de mesa se realizó en la temporada 2017/18. Presenta sistemicidad acropetala (ascendente). Para el control de botrytis está formulada en mezcla con pyrimethanil y por el momento se ha posicionado en el periodo de flor, siendo una interesante alternativa para ese periodo al tener también un efecto oidícida. Como antecedentes relevantes está el hecho de que valores EC50, tanto para germinación conidial como para elongación del tubo germinativo, obtenidos al determinar la línea base de sensibilidad previo a su uso, en aislados chilenos, asegurarían un control exitoso de la mayoría de los aislados resistentes y sensibles a boscalid (EC50 menor o igual a 1 y 0,1µg/mL., germinación de conidias y elongación de tubo germinativo, respectivamente) (Estudio U. de Chile/ Bayer S.A., 2014-15). Siempre y cuando en la población de botrytis del predio no se encuentren en una frecuencia importante las mutaciones H272L, H272V y la P225H o P225L. Como ya se indicó antes, por el momento la frecuencia de estas mutaciones es bajísima o nula en las poblaciones de botrytis en Chile, por lo que si se utiliza esta mezcla adecuadamente, no debería ser un problema. Para evitar riesgos de pérdida de sensibilidad en el futuro, sería importante realizar monitoreos periódicos de sensibilidad y analizar los cambios en la frecuencia de estas mutaciones en las poblaciones locales.

Isofetamida es otra molécula de este grupo, cuyo registro ad-portas en Chile posibilitará su uso en la temporada 2018/19. Estará disponible por el momento como ingrediente único y al igual que la mezcla de fluopyram & pyrimethanil, por ahora su posicionamiento inicial será floración. Los valores EC50 iniciales detectados, previo a su introducción, son muy similares a los de fluopyram (EC50 <1 µg/mL). Al igual que el caso anterior, controla la mayoría de los aislados resistentes a boscalid, pero no todos, por lo que también es importante mantener los monitoreos de los cambios de sensibilidad en las poblaciones tratadas.

La última de estas carboxamidas, que se encuentra actualmente en etapa final de desarrollo, es Adepidyn. Presenta alta eficacia en el control de botrytis y vendrá como formulación en mezcla con otro ingrediente activo, de manera de evitar riesgos de resistencia. Al igual que en los dos casos anteriores, controla tanto a los aislados sensibles como a la mayoría de los mutantes resistentes a boscalid, pero para su uso tendremos que esperar un poco porque su ingreso al mercado nacional se espera para el 2019 o 2020. Por el momento se vislumbra como una interesante alternativa ya que ejerce control sobre botrytis y sobre oídio, y su posicionamiento inicialmente también será para uno de los periodos críticos de infección más importantes, la floración.

Concluyendo, el uso de estas nuevas carboxamidas de alta eficiencia permitirá controlar eficazmente botrytis y a la vez recuperar el nivel de sensibilidad a boscalid. Esto es muy importante porque boscalid es una de las moléculas de alta eficiencia que presenta registro en los principales mercados de destino de la uva chilena.

Con estos antecedentes podríamos quedar todos contentos, pero para que la felicidad sea duradera, se van a tener que maximizar los esfuerzos de un uso adecuado de estas nuevas e interesantes herramientas de control, respecto de dosis y época(s) más oportunas de inclusión en los Programas de Control.

ASEGURAR MÁXIMA EFICACIA Y MÍNIMO RIESGO DE LAS CARBOXAMIDAS DE ÚLTIMA GENERACIÓN

Para un uso que aseguré una máxima eficacia y mínimo riesgo, debe además tenerse en cuenta:

¿Cómo ha sido la presión de selección ejercida hacia boscalid? (n° de aplicaciones de boscalid solo o en mezcla en al menos las 2 últimas temporadas).

¿Cómo ha sido el comportamiento de las poblaciones de botrytis en temporadas precedentes a boscalid? (niveles de sensibilidad al menos conocer los valores EC50).

¿Qué tipo de mutaciones son las predominantes en esa población?… El uso inadecuado de estas carboxamidas de alta eficiencia puede generar resistencias asociadas a mutaciones (cambios genéticos), que son más complicadas y que generan resistencia cruzadas positivas para todas las moléculas pertenecientes a este grupo. Como se ha indicado, sería un riesgo que debe y puede evitarse al considerar la realización de las medidas antes expuestas.

¿Cómo proteger la eficacia de las moléculas botryticidas de alta eficiencia? O Cómo hacer más sustentables los Programas de Control? La respuesta es evidente, primero utilizando estás herramientas de alta eficiencia considerando todas las recomendaciones generadas por las empresas fabricantes (dosis, época, mojamiento, etc..), posicionándolas según el nivel de sensibilidad a hydroxyanilidas y carboxamidas a nivel predial, y…. Mediante la incorporación de lo que nosotros hemos denominado desde 2016 como las Moléculas Alternativas no Residuales.

Entre estas moléculas, se encuentran los extractos de plantas, antagonistas biológicos y formulados en base activadores de mecanismos de defensa y biofertilizantes.

Entre los extractos de plantas, los primeros que se incorporaron en los programas de control de botrytis en uva de mesa fueron los extractos de cítricos, y el primero de éstos fue DF-100 (BC-1000) (1992), producto natural en base a ácidos carboxílicos, polifenoles y bioflavonoides producido a partir de extracto de semillas y pulpa de pomelo.  Su acción  preferentemente de contacto, afecta la permeabilidad de la membrana y respiración. En Chile se comprobó su eficacia como una herramienta orgánica natural antirresistencia en 1992, en donde la problemática de la resistencia era hacia los benzimidazoles y a las dicarboximidas, y la disponibilidad de fungicidas de mayor eficiencia en ese periodo a nivel nacional como a nivel mundial era crítica.

Posteriormente, varios formulados de extractos cítricos han sido introducidos en el mercado nacional (Citrus SL, Status SL, entre otros), los cuales se supone que presentarían un similar modo de acción que DF-100 y de ser así un nivel de control comparable. En este momento estamos evaluando la eficacia de algunos de éstos y aparentemente existirían ciertas diferencias.

Entre otros extractos de plantas, en este caso cabe destacar al formulado en base a la planta Melaleuca alternifolia (el aceite de la planta del Té), un aceite esencial volátil que presenta las mismas cualidades antes mencionadas para los extractos de cítricos, pero que además presenta control sobre oídio, lo cual es importantísimo si consideramos la alta incidencia que presentó esta enfermedad durante la temporada recién pasada. En diversos estudios efectuados en el país y en el extranjero, se ha podido determinar que además de destruir la integridad de la membrana celular y su permeabilidad, e inhibir la respiración, inhibiría la germinación de las esporas (conidias) y el desarrollo del micelio del hongo en los tejidos tratados. También incide en la producción de esporas (menor esporulación) y en la supresión de infecciones ya declaradas en el tejido vegetal (efecto secante) (Stockton Chile Ltda.). También en estudios recientes se ha determinado que estos efectos son consecuencia de cambios en la producción de metabolitos en las células de Botrytis cinerea, al inhibir en el hongo vías metabólicas primarias mediante la supresión del ácido tricarboxílico y el metabolismo de los ácidos grasos, provocándose con ello la disfunción mitocondrial y estrés oxidativo.

Figura 8. Efecto antagónico de Trichoderma sp. (Trichonativa), sobre: A) micelio B), esclerocios y C) crecimiento del antagonista sobre el raquis = disminución del inóculo en el parral y en el racimo.

ANTAGONISTAS BIOLÓGICOS

Entre los antagonistas biológicos destacan algunos productos formulados en base a cepas seleccionadas de Trichoderma spp. y Bacillus spp.

En el caso de los Trichodermas, su capacidad para ejercer control sobre botrytis y otros agentes fungosos se relaciona en primer lugar con la habilidad de competencia y de hiperparasitismo, antes que el efecto provocado en los patógenos vía producción de metabolitos específicos. Existen varios productos formulados en base a distintos aislados de Trichodermas, y su posicionamiento en general perseguía inicialmente la colonización del tejido vegetal previo a flor y de los restos florales senescentes en post-flor (aplicaciones al menos 7 a 10 días previo a flor y 10 días post-aplicaciones de fungicidas de alta eficiencia en término de flor) (Figura 8 C). En la actualidad, lo que se pretende con este tipo de formulados es realizar un control de ciclo completo. Es decir, además de estas aplicaciones, incluir en el programa de manejo agronómico de las vides de mesa aplicaciones de poscosecha en campo, y en pre y post-poda.

¿Cuál es el objetivo de estas nuevas aplicaciones de Trichoderma?

Con estas aplicaciones se cierra el ciclo, la idea es disminuir la fuente de inóculo que permanece en el parral y que lo que quede sea menos infectivo (esclerocios de plantas tratadas con trichodermas esporulan menos o no esporulan) (Figura 8), en tanto que con las aplicaciones de post-poda el objetivo es más amplio, además del efecto antagónico sobre botrytis, actuarían como protectores en cortes de poda, efecto complementario al uso de pastas de poda para el control de los hongos degradadores de madera. En las últimas 4 temporadas se han efectuado varios estudios comprobándose en alguno de éstos dicho efecto (convenios de investigación U. de Chile – Bio Insumos Nativa SpA.; U. de Chile – Adama S.A.). 

Pero, ¿cuál podría ser el principal problema de los formulados de trichodermas?

Si el control de botrytis es y debe ser siempre preventivo, las aplicaciones de los antagonistas biológicos, como los trichodermas, deben ser realizadas con mucha mayor antelación a una condición de infección, porque generalmente la tasa de crecimiento de los antagonistas es menor que la de los patógenos y porque se deben considerar dentro de un esquema de manejo integrado, en donde se realizan aplicaciones de fungicidas de alta eficiencia. Estos fungicidas controlan al patógeno pero también tendrán un efecto sobre las cepas antagónicas. Por ejemplo, según Bio Insumos Nativa SpA., en el caso de aplicaciones en pre o post-poda, si se ha considerado la aplicación de algún fungicida tradicional multisitio de amplio espectro en ese periodo, cuyo objetivo primario es evitar la contaminación de los cortes de poda por hongos degradadores de la madera, Mamull formulado en base a cepas de trichodermas recuperadas de ambientes fríos, debería ser aplicado al menos con un desfase de 7 a 10 días previo y al menos 14 días posterior a la aplicación de estos fungicidas. Esto último lo hemos comprobado en un estudio reciente, aun no terminado, que forma parte de un proyecto de investigación realizado vía convenio con Adama S.A.

Los Bacillus como antagonistas de botrytis y otros patógenos, también corresponden a una herramienta complementaria de uso en etapas preferentemente no críticas de infección. Por ejemplo, aplicaciones de Bacillus subtilis posterior a la de botryticidas de alta eficiencia de inicio de flor y/o previo a la aplicación de precosecha (fenhexamid), pueden contribuir en la protección de la eficacia de estos botryticidas.

Serenade, es uno de estos productos y está formulado en base al strain QST-713 de Bacillus subtilis, presenta acción fungicida y bactericida, provocando disrupción de la membrana celular, de modo que los lipopéptidos se introducen en la membrana celular y crean pequeños agujeros.  Además, según estudios realizados por AgraQuest/Bayer CropScience, también puede ser considerado como un activador de mecanismos de defensas, ya que activa sistémicamente las defensas internas de las plantas y las respuestas fisiológicas, al entrar en contacto con ésta.

Serifel es otro producto de esta misma línea, formulado en base a aislados de Bacillus amiloliquefaciens, que actualmente está en etapa de desarrollo y que será en el futuro otra alternativa a considerar en el diseño de programas de control.

Existen otros productos que también podrían considerarse como alternativos no residuales, como es el caso de formulados en base a hidrógenocarbonato de potasio, de acción de contacto, con efecto oídicida-botryticida, que puede ir intercalándose en el programa de aplicaciones.

Recientemente también se han incorporado en los programas de manejo en vides de mesa algunos biofertilizantes y también algunos reguladores fisiológicos de uso agrícola como Bio-Stim, y varios otros más de esta línea, actualmente en etapa final de desarrollo.

También en esta línea de moléculas alternativas no residuales, existen productos que no tienen un efecto fungicida real y que actúan mediante la activación de mecanismos de defensa en la planta, entre estos destaca acibenzolar-S-Methyl, conocido más como BION y el extracto de la planta Reynoutria sachalinensis (Regalia) y varios otros aún en etapa de desarrollo.

¿Qué es lo importante en estos últimos? Que al igual que los extractos de plantas, son solo alternativas complementarias a los fungicidas de alta eficiencia, ya que su efecto no es comparable al de estos; ni con los extractos de cítricos, ni con el aceite de la planta del té, porque no tienen un efecto fungicida directo. Su acción consiste en estimular los mecanismos de defensa naturales de las plantas y al hacerlo con antelación a una condición de infección, la planta está más protegida.

Concluyendo, las moléculas alternativas no residuales, por su composición, por ser formulados orgánicos naturales o antagonistas biológicos, como ya se ha reiterado, sin lugar a dudas que son importantes alternativas para ser incorporadas en los programas de control en periodos cercanos a cosecha, previo o entre las aplicaciones de los botryticidas de alta eficiencia. Pero nunca deben considerarse como reemplazo a estos, porque su eficacia de control es menor, y por lo tanto son solo un muy buen complemento. Ayudan a mantener la sensibilidad de las poblaciones a los botryticidas de síntesis de alta eficiencia ya que controlan tanto aislados sensibles como resistentes. Con ello se protege la eficacia de los fungicidas de alta eficiencia, y se contribuye con una producción de fruta sana y con menor carga residual, que es lo que actualmente exigen los mercados compradores de nuestra uva.

Figura 9. Evolución esperable de infecciones ocurridas en flor a distintos tiempos de almacenamiento refrigerado en poscosecha. Cuando falla el programa de flor o “LA IMPORTANCIA DEL PROGRAMA DE FLORACIÓN EN EL RESULTADO FINAL” (situación detectada en la fruta de uno de los predios asociados al Proyecto FIA-U. de Chile, PYT-2016-0243).

DISEÑO DE PROGRAMAS EXITOSOS DE CONTROL

Ya hemos indicado las herramientas existentes, los ingredientes de que podríamos disponer para diseñar nuestro programa, pero ¿Qué es fundamental considerar para lograrlo?

– En primer lugar, analizar los programas anteriores (al menos el de las últimas dos temporadas y sus resultados finales)

– Ojalá disponer de antecedentes de infección de post-aplicación de plena flor y el resultado al final de poscosecha en destino, o de datos de niveles de pudrición final de fruta guardada en frío en origen, necesitamos saber si el resultado final está o no, asociado con el programa de flor o con el de envero a cosecha.

– Necesitamos saber cómo son las poblaciones de Botrytis predominantes a nivel predial, no se trata de analizar todo, si no de seleccionar el cuartel más problemático y el menos problemático. Actualmente se sugiere determinar como es el comportamiento de sensibilidad a carboxamidas (boscalid) y a hydroxyanilidas (fenhexamid). Y si la presión de uso de otros fungicidas solos o en mezcla ha sido superior a lo recomendable “máximo 2 aplicaciones por temporada”, entonces, incluir estas otras moléculas para analizar su comportamiento.

 

TIPS IMPORTANTES EN EL DISEÑO DE UN PROGRAMA DE CONTROL EXITOSO

No considerar como base en los periodos críticos de infección, que son floración de inicio a término y desde envero a cosecha, fungicidas que no sean de alta eficiencia botryticida.

Aproximadamente 15 a 20 días antes de inicio de flor, considerar el uso de antagonistas biológicos, y después de esto, incluir un fungicida doble propósito (esta aplicación es antes de inicio de Flor).

A inicio de Flor, utilizar el fungicida de alta eficiencia al que la población local tenga una mayor sensibilidad, si no conocemos esta información se debe seleccionar de todos estos fungicidas el que presente el menor riesgo de generar resistencia. Si la floración de la temporada es larga (mayor a 5 días entre inicio y plena flor), incluir una aplicación de moléculas alternativas no residuales (M. alternifolia, o B. subtilis, o Hidrogenocarbonato de K, …).

Entre 50 y 80% de flor considerar aplicación de un segundo botryticida de alta eficiencia.

Es importante que en inicio y en plena flor no se utilice el fungicida que en el predio en particular se aplique más frecuentemente en precosecha. La floración es el periodo crítico de infección más importante, infecciones que no son controladas adecuadamente en flor son las causantes de los mayores incendios en poscosecha (Figura 9).

Entre post-flor y previo a cierre de racimo aplicar antagonistas biológicos (formulados en base a trichodermas, Ej.: Trichonativa) y 3 a 4 días posterior a esta aplicación en el caso de las variedades que tienen más restos florales y que estos restos no caen fácilmente en forma natural, (ej.: Thompson Seedless o Flame Seedles), eliminarlos mediante la aplicación de aire forzado.

En pre-envero, aplicación de algún botryticida que presente efecto botryticida y también sobre oídio, y que estimule respuestas fisiológicas en la planta, que incidan en una menor tendencia al desarrollo de microfisuras en las bayas, en una turgencia y color del escobajo óptima, y en unión de baya-pedicelo más firme, y para ello la mezcla pyraclostrobin & boscalid sería la indicada.

En envero seleccionar el botryticida de más alta eficiencia sobre la población y que además de controlar botrytis tenga un efecto sobre hongos asociados al síndrome de pudrición ácida.

Posterior a envero nuevamente tienen un rol importante las moléculas alternativas no residuales, las que permiten quebrar el riesgo de pérdida de sensibilidad a los botryticidas más importantes, que son la base de los programas de control. En precosecha el fungicida estrella por el momento continúa siendo fenhexamid.

Finalmente, y pensando no solo en la temporada que viene, si no también en la que vendrá, después de cosechar el último racimo, lo ideal sería realizar aplicaciones con fungicidas multisitio de amplio espectro de acción, que no se utilicen durante el periodo de crecimiento activo del racimo, y que por lo tanto sea aún más difícil y menos probable que botrytis desarrolle resistencia a estos. Con este tipo de aplicaciones lo que se pretende es controlar los aislados sensibles y resistentes tanto a hydroxyanilidas (fenhexamid/fenpyrazamine), como a carboxamidas.

Próximamente, al término del proyecto se entregará información detallada de cuáles de los programas diseñados en este estudio se comportaron como los Programas de Control más efectivos para controlar las poblaciones de distinto nivel de sensibilidad a dos de los grupos fungicidas considerados como botryticidas de alta eficiencia: Hydroxyanilidas (fenhexamid)/ Aminopyrazolinonas (fenpyrazamine) y las Carboxamidas (boscalid).

Si las poblaciones se comportan como de moderada o alta resistencia, sería importante estudiar la posibilidad de realizar un análisis más detallado, ya que lo que se busca es asociar la causa de la pérdida de sensibilidad a fenhexamid o a boscalid, al tipo y frecuencia de mutaciones. Así podremos saber si el problema será más fácil o difícil de solucionar e incluso si es necesario o no, la incorporación del fungicida problemático en el diseño del siguiente Programa de Control, por ejemplo algunas mutaciones asociadas a pérdida de sensibilidad a algunos fungicidas generan un trabajo excesivo para el hongo (costo metabólico alto), y aunque el hongo es capaz de resistir concentraciones altas del fungicida, disminuye su capacidad de sobrevivencia, su agresividad y o  nivel de esporulación, etc …, y por lo tanto no incidiría tan negativamente en la eficacia del programa.

En el proyecto FIA que estamos terminando nos planteamos como objetivo general el diseñar Programas Óptimos de Control, pero les pusimos además otros atributos. Esos programas deberían ser eficientes y sustentables.

Como objetivos específicos necesitábamos optimizar las técnicas de diagnóstico de sensibilidad mediante análisis moleculares más eficientes (q-PCR / HRM) para detectar las mutaciones a dos de las moléculas botryticidas de alta eficiencia más utilizadas y que han presentado en el último tiempo los mayores niveles de pérdida de sensibilidad: fenhexamid y boscalid, y lo hicimos.

Y en base a la información obtenida (resultados) diseñamos algunos programas de control para cada predio en particular (10 predios), posicionando en el programa al fungicida de mayor sensibilidad al inicio de flor, y después, como ya lo hemos indicado, íbamos intercalando alguna de las alternativas no residuales entre las otras aplicaciones importantes de flor (50 a 80% de flor y término de flor) y en las de previo a envero y entre las de envero y precosecha.

Los resultados obtenidos señalan que incluso en una sola temporada, al realizar un programa adecuado, es posible obtener la recuperación de sensibilidad de las poblaciones y un control exitoso de botrytis.